服務介紹
外泌體提取和鑒定是一種實驗技術，用於從生物樣本中分離和分析外泌體。外泌體是細胞釋放的小型囊泡，攜帶有脂質、蛋白質、核酸等生物分子。提取過程通過特定處理步驟將外泌體從樣本中純化出來，而鑒定過程則利用多種方法對外泌體進行分析，包括形態學觀察和分子分析。外泌體提取和鑒定技術被廣泛應用於生物醫藥研究，有助於了解細胞間通訊、研究疾病機製、發現生物標誌物等。
外泌體（exosome），特指直徑在40-100nm的盤狀囊泡。其主要來源於細胞內內溶酶體微粒內陷形成的多囊泡體，經多囊泡體外膜與細胞膜融合後釋放到胞外基質中。現已證實可以分泌外泌體的細胞有：肥大細胞、淋巴細胞、樹突狀細胞、腫瘤細胞、間充質幹細胞等。
外泌體在免疫中抗原呈遞、腫瘤的生長與遷移、組織損傷的修複等生理病理上起著重要的作用。同時，不同細胞分泌的外泌體具有不用的組成成分和功能，可作為疾病診斷的生物標誌物。
服務優勢
- 先進技術：應用先進的提取和鑒定技術，確保高效、可靠的服務。
- 高質量數據：專業團隊進行準確分析和解讀，提供可靠的結果和報告。
- 個性化方案：根據客戶需求提供定製化解決方案，緊密配合研究項目。
- 保密與可靠性：嚴格保護客戶樣品和數據信息，提供安全可靠的服務。
- 快速交付：高效的實驗流程和操作經驗，及時交付結果，滿足時間要求。
服務流程
客戶提供
血清、血漿、唾液、尿液等體液、細胞上清、植物樣品等其它特殊樣品
樣品送樣要求：
1、血清：使用無添加劑采血管采血；使用RNase-free的離心管；送樣量＞4ml
2、血漿：不可使用肝素抗凝；溶血樣本不建議使用，及時處理，避免劇烈晃動；送樣量＞4ml
3、細胞上清：使用無外泌體血清培養；離心去除細胞碎片；防支原體等微生物汙染；送樣量＞20ml
4、植物樣本：植物組織
最終交付
- 外泌體粒徑、濃度檢測報告
- WB檢測結果
- q-PCR相關檢測結果
- 電鏡圖片
- NGS測序結題報告
- 蛋白組學結題報告
- 特殊服務：外泌體整體方案設計探討
- （根據具體項目確定交付）
服務說明
案例展示
在線課堂
常見問題與解析 (Q&A)
在外泌體當中，含有大量疾病相關的多種RNA分子，如miRNA，mRNA，lncRNA等，而外泌體中RNA含量的高低主要是通過熒光定量PCR來鑒定。但是如果出現檢測內參不齊，就會限製RNA分子定量檢測的標準，而引入外參在外泌體RNA定量分析中是另外一種可選的有效手段。外參法主要是在檢測過程中，加入到待檢測樣本中的外源性物質，加入的外源性物質可以很精確的反映不同樣本在檢測過程中出現的偏差。所以若是出現內參不齊時，可以考慮引入外參。
ELISA可以用來檢測樣本中特定蛋白或細胞因子含量，同樣也是可以用來檢測外泌體中一些標誌性蛋白。ELISA試劑盒檢測的樣本是有多種類型的，如血清、血漿、尿液、細胞培養上清或組織勻漿液等，對於不同的樣本，前期的處理方式也是不同的， 對於ELISA實驗的來說，實驗樣本的處理非常關鍵。在處理過程中，使提取溶劑與容器內的樣品充分接觸以深入到樣本組織內部，提取待測成分。在淨化過程中加入的溶劑，可能會降低待測組分的濃度或者不適宜直接分析，需要去除全部有機溶劑。同時要對盡量去除待測樣本中的雜質，以防幹擾實驗結果。
正常情況下，血清中外泌體的含量還是很高的。一般常規實驗血清純化外泌體，建議可以先對外泌體進行鑒定，通過電鏡檢測觀察一下外泌體的是否具有杯狀結構，然後通過NTA檢測一下粒徑大小和粒徑濃度，確定沒問題進行再進行WB驗證。 WB實驗失敗的一些原因：（1）抗體染色不充分，可以增加抗體濃度，延長孵育時間進行改善。（2）檢查酶是否失活，可以直接將酶和底物進行混合，如果不顯色則說明酶失活了。選擇在有效期內、有活性的酶聯物。（3）可以增加陽性對照，如果陽性對照有結果，但標本沒有，則可能是標本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低。可以增加標本上樣量解決靶蛋白含量低的原因。（4）檢查抗體是否失效，看抗體是否過期，工作液盡量現配現用。
目前外泌體蛋白提取的方法相對較少，有的可以通過購買試劑盒來購買提取外泌體蛋白。在一篇專利中提到如何提取血清中的外泌體，專利申請號：CN201810287204.6 專利名稱：提取外泌體及外泌體蛋白的方法 提取外泌體方法步驟：所得含有外泌體的材料(即洗滌後的沉澱)置於冰上，向其中加入18μL4g/100mL的SDS水溶液，然後超聲(超聲條件在100W下進行)裂解20分鍾，得到超聲產物；將超聲產物在16000g下離心5分鍾，收集全部上清液；向上清液中加入82μL 8M尿素水溶液和二硫蘇糖醇，得到裂解液，該裂解液中二硫蘇糖醇的濃度為20mmol/L；將該裂解液在37℃孵育4小時，得到裂解產物；將裂解產物轉移至FASP管中，用8M尿素水溶液洗滌(FASP管是一種按分子量截留的管，洗滌過程都是通過離心完成，離心條件為14000g離心10分鍾，離心以後，絕大部分溶液和小分子物質被離心至下層接收管子裏，外泌體被截留在上層的FASP管中)2次；然後加入碘乙酰胺(終濃度50mmol/L)，室溫下避光反應1小時，用50mM碳酸氫銨水溶液洗滌3次，加入1μg胰蛋白酶，37℃酶切12小時，將所得溶液45℃熱幹，用0.1％(v/v)甲酸水溶液定容，得到外泌體蛋白提取液，將外泌體蛋白提取液上樣進行LC-MS/MS分析，上樣量為1μg。所得含有外泌體的材料(即洗滌後的沉澱)置於冰上，向其中加入18μL4g/100mL的SDS水溶液，然後超聲(超聲條件在100W下進行)裂解20分鍾，得到超聲產物；將超聲產物在16000g下離心5分鍾，收集全部上清液；向上清液中加入82μL 8M尿素水溶液和二硫蘇糖醇，得到裂解液，該裂解液中二硫蘇糖醇的濃度為20mmol/L；將該裂解液在37℃孵育4小時，得到裂解產物；將裂解產物轉移至FASP管中，用8M尿素水溶液洗滌(FASP管是一種按分子量截留的管，洗滌過程都是通過離心完成，離心條件為14000g離心10分鍾，離心以後，絕大部分溶液和小分子物質被離心至下層接收管子裏，外泌體被截留在上層的FASP管中)2次；然後加入碘乙酰胺(終濃度50mmol/L)，室溫下避光反應1小時，用50mM碳酸氫銨水溶液洗滌3次，加入1μg胰蛋白酶，37℃酶切12小時，將所得溶液45℃熱幹，用0.1％(v/v)甲酸水溶液定容，得到外泌體蛋白提取液，將外泌體蛋白提取液上樣進行LC-MS/MS分析，上樣量為1μg。
相關資源
1、一些常見的外泌體提取方法的優劣對比
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提取方法 |
概念 |
優勢 |
劣勢 |
| 超速離心法 | 利用離心力將外泌體從生物樣本中分離出來 |
相對簡單、常用；可適用於大多數樣本類型； 適用於大規模提取 |
需要多次離心步驟； 易受到細胞碎片和蛋白質汙染 |
| 超濾法 | 通過濾膜篩選外泌體，根據大小分離 | 快速、高效；適用於大樣本體積 | 大分子物質與外泌體的分離效果可能不理想 |
| 密度梯度離心法 | 利用密度梯度離心介質，根據密度差異純化外泌體 | 提取純度較高；適用於小樣本量 |
操作複雜，耗時較長； 對離心速度和時間要求較高 |
| 免疫沉澱法 | 利用特定抗體與外泌體表麵標記分子的相互作用進行提取 | 特異性高，可用於純化特定標記的外泌體 |
需要有特異性抗體； 提取純度可能受到抗體效能的影響 |
| 多步驟聯合方法 |
結合多個提取方法的優點， 利用不同步驟提高提取純度和產量 |
提取效果綜合優於單一方法；適用於複雜樣本 |
操作複雜，耗時較長； 可能會引入額外的汙染或失去部分樣本 |
2、外泌體研究的常見思路
● 外泌體生物學特性研究：了解外泌體的起源、形成機製、分泌調控以及其在細胞間的傳遞方式和動態變化。這個思路可以通過細胞培養、分離和純化外泌體、使用顯微鏡觀察外泌體形態學特征、分析外泌體的成分和分子組成等來探索。
● 外泌體功能研究：研究外泌體在細胞間的信息傳遞、信號調控、基因轉移、免疫調節等方麵的功能。可以通過外泌體與接受者細胞的共培養實驗、外泌體攝取實驗、功能分析等方法來揭示外泌體的功能機製。
● 外泌體在疾病中的作用研究：探索外泌體在不同疾病發生、發展和轉移過程中的作用機製，如癌症、心血管疾病、神經退行性疾病等。可以通過臨床樣本分析、動物模型研究、體外實驗等方法來研究外泌體在疾病中的作用和潛在應用。
● 外泌體作為生物標誌物的研究：尋找外泌體中特定分子、蛋白質、核酸等作為生物標誌物，用於疾病的診斷、預後評估和治療監測等臨床應用。可以通過分子標記和成分分析、臨床樣本分析等方法來研究外泌體作為生物標誌物的潛力。
● 外泌體工程研究：利用基因工程和納米技術等方法，改變外泌體的產生、組成和功能，以實現藥物遞送、基因治療和再生醫學等方麵的應用。可以通過外泌體工程和功能研究相結合的方法來探索外泌體在醫學領域的應用前景。
這些思路可以相互交叉和結合，根據具體的研究目的和問題，選擇合適的研究方法和實驗設計，從不同角度深入研究外泌體的生物學特性和功能，以及其在疾病診斷和治療中的潛在應用。
3、外泌體研究中一些常用的數據庫和資源庫
● ExoCarta：ExoCarta是一個廣泛被引用的外泌體數據庫，收集了來自不同物種和細胞類型的外泌體相關數據，包括外泌體蛋白質、miRNA和脂質等成分的信息。
● EVpedia：EVpedia是一個綜合性的外泌體數據庫，提供了外泌體相關的蛋白質、miRNA、脂質等分子組成信息，並提供了相應的注釋、實驗方法和參考文獻。
● Vesiclepedia：Vesiclepedia是一個外泌體和細胞外囊泡相關的數據庫，提供了來自多個物種的外泌體和囊泡的蛋白質組學數據，幫助研究者進行外泌體的研究和分析。
● miRBase：miRBase是一個全麵收集整理miRNA序列和注釋信息的數據庫，研究者可以在該數據庫中查詢和下載與外泌體相關的miRNA信息。
● GEO（Gene Expression Omnibus）：GEO是一個公共基因表達數據的數據庫，研究者可以在其中找到與外泌體相關的轉錄組數據集，用於進一步分析和挖掘外泌體的功能和調控網絡。
● TCGA（The Cancer Genome Atlas）：TCGA是一個癌症基因組學數據的資源庫，其中包含了大量癌症患者的臨床數據、轉錄組數據和蛋白質組數據等，研究者可以在其中尋找與外泌體相關的癌症數據。
● PubMed：PubMed是一個生物醫學文獻數據庫，其中包含了豐富的外泌體研究相關的科學論文和綜述文章，研究者可以在其中查找最新的外泌體研究進展和相關文獻。
