基因服務&測序

一般，菌體的形態有：平板培養菌、穿刺培養菌，甘油保存菌或新鮮菌液等。我們提倡寄送穿刺培養菌或新鮮菌液。   平板培養菌運送特別不方便，我們收到的一些平板培養菌的培養皿在運送過程中常常已經破碎，麵目全非，需要用戶重新寄樣。這樣既誤時間，又浪費客戶的樣品。一旦是客戶非常重要的樣品時，其後果更不可設想。而甘油保存菌則容易汙染。   製作穿刺菌時，可在1.5 ml的Tube管中加入瓊脂培養基，把菌體用牙簽穿刺於瓊脂培養基（固體）中,37℃培養一個晚上後便可使用。穿刺培養菌在4℃下可保存數個月，並且不容易汙染，便於運送。

(1) 擴增產物必須特異性擴增，條帶單一。如果擴增產物中存在非特異性擴增產物，一般難以得到好的測序結果。   (2) 必須進行膠回收純化。   (3) DNA純化在1.6~2.0之間，濃度50ng/µl以上。

如果不進行膠純化而直接用試劑盒回收，經常會導致測序出現雙峰甚至亂峰。這主要是非特異性擴增產物或者原來的PCR產物去除不幹淨導致。大多數所謂的PCR"純化試劑盒"實際上隻是回收產物而不能起到純化的作用。對於非特異擴增產物產物肯定是無法去除，而且通常它們不能夠完全去除所有的PCR引物，這會造成殘留的引物在測序反應過程中參與反應而導致亂峰。

PCR產物首先必須用Agarose膠電泳，將目的條帶切割下，然後純化。使用凝膠回收試劑盒回收。產物用ddH2O溶解。

對於測序用質粒DNA的一般要求：   (1) DNA純度高，1.6~2.0之間，不能有混合模板，也不能含有RNA，染色體DNA，蛋白質等。   (2) 溶於ddH2O中，溶液不能含雜質，如鹽類或EDTA等螯合劑，否則將幹擾測序反應的正常進行。

我們使用水平瓊脂糖凝膠電泳，並在膠中加入0.5ug/ml的EB，加入一個已知濃度的標準樣品。電泳結束後在紫外燈下比較亮度，判斷濃度和純度。此方法可以更直接、準確地判斷樣品中是否含有染色體DNA、RNA等，也可以鑒別抽提的質粒DNA的不同構型。   質粒DNA的3種構型是指在抽提質粒DNA過程中，由於各種原因的影響，使得超螺旋的共價閉合環狀的質粒（SC）的一條鏈斷裂，變成開環狀（OC）分子，如果兩條鏈發生斷裂，就變成線狀（L）。這3種分子有不同的遷移率，通常，超螺旋（SC）遷移速度最快，其次是線狀（L）分子，最慢為開環狀（OC）分子。使用紫外分光光度計檢測，或者用EB-標準濃度DNA比較法隻能檢測抽提到的產物中的濃度，甚至由於抽提的質粒DNA中含有RNA、蛋白質、染色體DNA等因素的幹擾，濃度檢測的數值也是沒有多少意義的。

對測序引物的一般要求：   (1) 特異性與測序模板結合，不能有多於4個堿基以上的錯配現象   (2) 不能含有混合堿基   (3) 長度17~25堿基   (4) 純度高，最好PAGE純化   (5) 用ddH2O溶解，不要用TE緩衝液溶解。

測序引物與待測樣品DNA分子隻能有一個結合位點是測序成功的關鍵。如果測序引物在DNA模板分子上有不隻一個的結合位點，將造成測序反應過程中引物鏈在幾個結合位點處同時擴增，反映在測序峰圖上將出現雙峰或亂峰，無法讀取序列。

PCR產物測序出現套峰現象，一般有以下幾種原因：   (1) PCR用模板不純或PCR用引物特異性不好，擴增出的產物除了目的片段外，還有與目的片段長度相近的片段，即使用凝膠電泳也無法分離開，這樣的PCR產物測序結果是套峰。   (2) 結構上的原因，造成了PCR產物測序出現套峰的現象。PolyA/G/C/T以及原因不明的複雜結構的存在，都會出現測序結果套峰的情況。

在測序反應中，模板或引物的原因都可能造成套峰的形成，歸結其形成原因有以下幾點   (1) 測序引物在模板上有兩個結合位點形成套峰   (2) 模板不純，如果是質粒或是菌液，原因是非單克隆，如果是PCR,原因為非特異性條帶   (3) 模板序列的特殊結構，如poly結構、發卡結構等   (4) 引物降解，引物不純，或引物的特異性不好

這裏分四種情況：   (1) 的確找不到測序使用的引物序列。目前使用的測序方法是在ddNTP上做熒光標記，測序儀通過檢測ddNTP上的熒光來讀取序列，因為引物本身是不做熒光標記的，所測序列是從引物3' 末端後第一個堿基開始的，所以在測序結果上找不到測序引物的序列。如果是PCR產物，要想得到PCR引物的序列，可以將PCR產物進行雙鏈測通或者將PCR產物克隆到載體上，用載體上的引物（注意此引物也不能離插入片段太近）測序   (2) 找不到克隆片段的擴增引物。原因可能是您在構建質粒時采用的工具酶的酶切位點距離您的測序引物太近，由於熒光染料的幹擾在序列開始的部分不會十分準確   (3) 還有一種可能是您的插入片段的插入方向是反的，這時您不妨找一下您引物的互補序列   (4) 存在單引物擴增，有一條引物的特異性不好，有多個結合位點導致隻有一條引物參與擴增

眾所周知，PCR擴增過程中會出現很多錯配現象，但不可能所有的錯配都發生在同一位置。PCR片段直接測序時，其結果是PCR片段眾多分子的混合物的結果。如果在某一個點上出現了幾十次錯配現象，但大多數分子（或許是幾十萬個分子）在這個點上應該還是正確的，在測序時，錯配現象也就反映不出來了。因此，PCR片段直接測序的結果反映的是PCR用模板最原始的結果。而PCR片段經克隆後測序是測定了某一個分子的DNA序列。在幾十個循環的PCR擴增過程中，很難保證某一個分子的任何點都不發生錯配。因此，PCR片段經克隆後的測序結果，往往存在著一些錯配的序列，和PCR片段直接測序的結果相比有些堿基會有所不同。這種錯配現象的多少取決於PCR擴增時使用的DNA聚合酶的保真性能。要減少PCR擴增過程中的錯配現象，在PCR反應時，請選用保真性能高的DNA聚合酶。

一段基因序列經擴增後，克隆到載體中進行測序。在兩個層次上可能導致序列發生變化。首先，在PCR擴增過程中就可能產生錯誤，將片段克隆到載體中也有可能發生突變；其次，測序的準確率問題。 ABI公司承諾其儀器的測序精度在一定範圍內可以達到98.5%以上。由於儀器準確率的限製，在一個較長的序列中發生堿基序列錯誤是難以避免的。在確認克隆無誤的情況下，通過雙向測序可以最大限度減少測序的錯誤。您如果想得到您的最準確的序列，進行雙向測序是很有必要的。隻進行簡單的單向測序，我們無法保證所測序列的完全準確性，這是由儀器的精度決定的。

客戶需要將測序樣品或引物（客戶自帶的）返還時，我們在發送測序報告的同時，按客戶要求寄回樣品或引物（客戶自帶的)。   2）對於沒返回的測序樣品和引物，公司負責保存二個月（從樣品收到之日算起)，超過二個月還需測序的樣品，請客戶另行提供。

測序用引物要求非常嚴格，不同於PCR用引物。PCR用引物一般隻要能和模板結合，3' 端的幾個堿基能完全配對，即使引物長達80~100多個堿基，隻要調整PCR反應條件，也能成功進行PCR反應。   而測序用引物便不一樣了，必須嚴格符合以下要求。本公司的測序用引物全用引物設計軟件Oligo設計。在本公司測序時，我們可免費幫助設計測序用引物。   ●長度在15~25個堿基左右，一般選擇20個堿基（根據GC含量作適當調整)，3' 端盡量選擇G或C堿基（但不絕對），以增加與模板的結合能力。   ●Tm溫度應選擇50℃~70℃左右。   ●GC含量應選擇在50%左右，盡量避開A、T、G、C的連續結構。   ●避開引物自身形成發夾結構或引物二聚體結構等複雜結構。   ●保證引物和模板100%匹配，特別是3'端的幾個堿基一定要100%匹配。同時必須嚴格保證引物和模板之間隻能有一個結合位點。

在檢查報告時，設備和我們的技術員都傾向於提供給客戶一個單一的信號，所以在出現雜合的位置上給出的信號往往是比較強的一個信號。所以如果您的PCR樣品上是存在雜合位點的，請在測序訂單上注明，我們在修改報告時會加以注意。但如果在您預期出現雜合信號的位置上隻有單一的信號，那麼我們是不會人為將其修改為雜合位點的。出現這樣的情況可能是在您的樣品中雜合成份太少的信號強度不足以被檢查到，也許有其他更加靈敏的檢測手段可以滿足您的要求。

超過6Kb的DNA片斷用Shot Gun 進行測序準確並且節省時間， Shot Gun方法如下：   (1) 用物理方法打碎DNA   (2) 回收1~1.5K的片斷   (3) 用核酸酶切平端，連接入載體   (4) 按照一定比例進行測序，保證每一個區段有3倍以上的數據   (5) 編輯所有測序數據   (6) 如果有缺少數據的區域，還需要補充測序，拚接成完整序列

ABI3730測序儀是采用AB公司配套的Big DYE Terminator cycle sequencing Kit，其準確性達到800堿基隻有1個以下的錯誤，並且該測序儀對堿基的判讀有一個自身的評判值（Quality Value），根據QV值的大小，也可以幫助我們來判斷每一個堿基的準確程度

有的客戶想用測序的方法檢測點突變體，我認為該方法可靠性不高。主要有以下兩個原因。首先，我們並不清楚突變的序列與正常的序列的比例是多少。測序反應的信號強度直接與模板的量有關，如果突變的模板所占的比例很少，將直接作為背景噪音了，很難檢測出來。隻有當測序反應體係中正常的和突變的模板量比較接近時，才能較可靠地檢測到突變體的存在。其次，在同一位置，不同堿基的信號強度一般是不一樣的。這樣即使突變的模板所占的比較較高時，也不一定能準確檢測到突變的存在。   另外，測序儀是設計用來測序正常的堿基序列的，軟件在對掃描的結果進行處理時，會盡量提高主峰而將背景信號盡量壓低，以得到盡可能好的結果。因此，當某處出現雙峰時，測序儀一般會認為信號弱的峰為背景信號，在處理過程中，將弱的峰進一步壓低，這樣不利於突變體的檢測。因此認為，用測序的方法檢測突變體的存在不是一個好的方法。