蛋白質組學分析

金開瑞目前使用的是ABSCIEX的5600 plus質譜儀和 Q Exactive™ HF 組合型四極杆-Orbitrap MS。儀器性能：1靈敏度高：達到高端QQQ的MRM的定量靈敏度；2高分辨：全質量範圍內至少30000的分辨率；3高質量準確度：外標1 ppm；4超快的分析速度：掃描速度每秒一百張MS或MS/MS圖譜，是其它高分辨質譜的5-10倍，達到三重四級杆MRM的掃描速度；5定量線性範圍寬：超過4個數量級。

金開瑞蛋白質組學平台可接收的樣本包括膠點/膠條、蛋白溶液、動物組織、植物組織、真菌、細菌、細胞樣品、體液樣品、血清/血漿等，還可接收石蠟切片等特殊樣本。具體樣本需求量和注意事項，請參考《金開瑞蛋白質組學樣品準備注意事項》 細胞、組織、蛋白溶液、菌體等樣品最好采用幹冰運輸，對於SDS-PAGE條帶和2D點以及酶解好的肽段樣品直接常溫運輸即可。可以理解為需要提取蛋白或提取好的蛋白樣品（易降解）都需要低溫運輸，而處於凝膠中的蛋白或者是酶解好的肽段可常溫運輸。

可以大規模鑒定特定組織、細胞等各種樣本的蛋白質種類、修飾狀態以及蛋白質之間的相互作用，以及對這些蛋白質功能分析、分類； 可以對不同條件下某一特定樣本進行大規模的蛋白質(包括翻譯後修飾蛋白)表達量變化分析，篩選潛在biomarker，篩選重要信號通路； 依托大樣本量，可以實現疾病的分子分型分析、重要潛在靶標鑒定。

兩種方法側重點不同，基於質譜的蛋白質組學技術一般是用來做高通量發現、篩選潛在biomarker、蛋白互作研究、大規模翻譯後修飾水平研究；基於芯片的方法往往是大規模研究或驗證已知蛋白蛋，做定量分析、蛋白互作分析等。前者屬於無目的性的研究所有蛋白，然後篩選感興趣蛋白。後者屬於已經知道感興趣蛋白，然後做進一步研究。

若有對應物種的全基因組並有預測的全蛋白序列庫，可優先選擇全蛋白序列庫；若無全蛋白序列庫，有對應物種對應組織（器官等）的轉錄組測序結果並，可以使用轉錄組的測序結果（mRNA三框翻譯或者預測CDS，並翻譯成氨基酸序列）；若基因組、轉錄組數據庫都沒有，優先選擇同源性最接近的物種的全蛋白數據庫，若近源物種沒有合適的全蛋白庫，則選擇更大的蛋白全庫（如動物全庫、綠色植物全庫、微生物庫等）。

因為當前大量的物種已經測序，預測了相應的基因，未測序的物種可以通過近緣物種的基因序列作為數據庫進行蛋白質組的研究。因此，一般來說，未測序物種可以考慮近緣物種的基因組序列作為數據庫，可以做蛋白質組。

因抗體質量問題，IP實驗本身存在假陽性，此種情況質譜能檢測到目標蛋白的概率較低；若IP實驗沒問題，但質譜未鑒定到目標蛋白的可能原因有：① 目標蛋白與抗體結合不強，IP洗脫時因太過劇烈導致實際結合的目標蛋白非常少，達不到質譜要求的靈敏度；② 樣品中存在高豐度汙染蛋白，其信號覆蓋了目標蛋白的信號，導致未能鑒定到。解決方案：調整IP實驗，如更換抗體（不同廠家更換）、改變洗脫策略（由劇烈變緩和），實驗過程嚴格控製操作環境，避免引入大量汙染蛋白。

生物學重複是指不同生物個體或者不同生物群體的樣品之間進行地相同處理而進行的實驗，而技術重複是指同一樣品進行的多次相同實驗。舉例：對來自三隻健康小鼠A、B、C的血清樣品分別各進行一次雙向電泳，這三次雙向電泳就是生物學重複；而取其中一隻小鼠的血清樣品進行三次雙向電泳，或者將三隻小鼠的血清混合後的樣品進行三次雙向電泳，這三次實驗就是技術重複。總結生物學重複的樣品來自不同的個體或者是群體，重複之間樣品不同；而技術重複的幾次實驗的樣品完全相同，可以來自單一個體，也可以是多個個體的混合樣品，但用於重複實驗的樣品完全一樣。

Label free需要進行三次重複，而iTRAQ、TMT一般也建議您做3次實驗重複，如果實驗方案後期設計了大量的驗證實驗如WB或ELISA等，最好做也能做兩次重複；如果不進行重複實驗後期的驗證實驗也少，在後期發表文章的時候結果可能會受到一些審稿人的質疑，從而影響文章的發表，特別是一些高分雜誌較為突出。 如果是進行技術重複，各實驗結果之間的數據重複性會更好，而生物學重複由於多種原因可能導致重複性與偏差或者不好，一般情況下Label free最好使用技術重複，這樣有利於後續數據的分析，而其他是實驗可以采用生物學重複或者技術重複。代謝組根據樣品的不同選擇合適的數量進行生物學重複。

由於生物學樣本，本身之間就具有個體差異，我們不能保證任何兩者的比值的皮爾森相關係數都能達到0.8以上，但保證結果質量符合一般雜誌要求。

全譜分析和定量分析它們分別能鑒定到的蛋白數，跟樣品的複雜度和樣品製備方法有較大關係。一般情況下，常規樣本全譜分析能鑒定到1000～3000個蛋白，定量蛋白質組學能鑒定到2000～6000個蛋白。

驗證方法包括WB、IHC、q-PRC，以及基於質譜的PRM等。不一致時，首先考驗證方法、操作是否有問題（可重複做）；還可以考慮換其他驗證方法；實在不行，需要考慮組學定量結果可能存在假陽性，需要重現篩選差異靶點。

需要研究人員根據自己研究的相關生物學背景，再結合生物信息學分析的結果，以及查看相關的文獻資料來確認哪些蛋白可以用於後續深入的研究。

目前一般文獻中的分析主要為維恩圖分析、熱圖分析、火山圖分析、層次聚類分析、蛋白質功能分析（GO分類為主）、蛋白質所屬代謝通路富集分析（基於KEGG的pathway）、差異蛋白互作網絡構建、轉錄因子預測等方麵。 其它一些比較特異的高級分析包括多組數據關聯分析、多pathway延伸分析、磷酸蛋白激酶預測分析、互作網絡及生物調控模型構建分析。

常見期刊包括有MCP (molecular & cellular proteomics), JPR(journal of proteome research), Proteomics, Journal of Prteomics, Electrophoresis, Plos One, BMC Genomics, Expert Rev Proteomics, BMC Syst Biol, OMICS, Proteomics Clin Appl, Proteome Sci等。

基於質譜多反應監測(Multiple Reaction Monitoring，MRM)技術的目標蛋白分析，可以有目標地分析檢測那些被認為可能與特殊功能相關的關鍵蛋白在大規模樣本中的表達量。 工作原理是，基於已知信息或假定信息設定質譜檢測規則，對符合規則的離子進行信號記錄，去除大量不符合規則離子信號的幹擾，是一種高特異性、高靈敏度的質譜數據獲取方式。

全譜分析和定量分析它們分別能鑒定到的蛋白數，跟樣品的複雜度和樣品製備方法有較大關係。一般情況下，全譜分析能鑒定到1000～2000個蛋白。由於定量分析在獲得的譜圖上會比全譜分析少20%，因此，定量分析可能會比全譜鑒定到的蛋白數少些。 蛋白全譜分析：常規樣本，1000～3000（具體跟物種、樣本類型有關係）； 定量蛋白組學：常規樣本2000-6000（具體跟物種、樣本類型以及組學技術掛鉤）。

1.  雖然這兩個庫的目的都是為了找的描述上的標準化，但是它們是由不同的組織機構整理的，你可以觀察到哪怕同一個過程，GO和KEGG的基因都不一樣，因為人們對它的理解都不同。不僅如此，不同的通路數據庫之間的收集整理都不一樣。2. GO偏向於分子的共同屬性（比如都參與到了水解過程）的整理歸納，而且GO數據庫是通過對共同屬性進行的級層管理，比如一個公司有好多自上而下的管理部門，大的管小的，你分子隻要是這個部門的就行，不管分子之間關係如何；而KEGG偏重於 部門內部的關係，誰和誰關係好（激活），誰和誰關係差（抑製），誰和誰得通過誰傳達任務（信號轉導）。 所以，通過GO，你可以了解到一家公司的管理結構。通過KEGG，你可以了解一家公司的內部人和人之間的關係。3. 但是，你如果通過公共的數據庫，是沒有辦法同時了解到二者可以完全吻合的信息，因為管理庫的人不一樣。所以，如果可以，你需要找到GO和pathway是同一個機構整理的數據庫，這樣才可以更完整的把這家“公司”的信息搞明白。

隻要物種在蛋白質組數據庫中存在足夠多的數據、基因組已知或  EST（或轉錄組）數據足夠豐富，均可進行蛋白質組全譜分析。對以上條件均不滿足的物種，可在進行蛋白質組全 譜分析的同時，做一個基因組或轉錄組測序，以便為蛋白質組全譜分析提供支持。因此，理論上，所有的物種均可進行蛋白質組全譜分析。