分子/免疫學檢測

（1）WB（Western Blot ）蛋白免疫印跡雜交 ： 是將蛋白樣本通過聚丙烯酰胺電泳按分子量大小分離，再轉移到雜交膜（blot）上，然後通過一抗/二抗複合物對靶蛋白進行特異性檢測的方法。 （2）IHC /ICC（Immunohistochemistry/Immunocytochemistry ）免疫組織/細胞化學是應用免疫學基本原理--抗原抗體反應，即抗原與抗體特異性結合的原理，通過化學反應使標記抗體的顯色劑 （熒光素、酶、金屬離子、同位素） 顯色來確定組織細胞內抗原（多肽和蛋白質），對其進行定位、定性及定量的研究 （3）IF （Immunofluorescence ）免疫熒光：是在免疫學、生物化學和顯微鏡技術的基礎上建立起來的一項技術。它是根據抗原抗體反應的原理，先將已知的抗原或抗體標記上熒光基團，再用這種熒光抗體（或抗原）作為探針檢查細胞或組織內的相應抗原（或抗體）。利用熒光顯微鏡可以看見熒光所在的細胞或組織，從而確定抗原或抗體的性質和定位，以及利用定量技術（比如流式細胞儀）測定含量。 ICC通過酶反應顯色，IF主要測熒光；用的抗體和識別的表位是一樣的，做法幾乎一樣。隻是標記二抗不一樣。

多抗是免疫動物後得到的抗血清經純化得到的抗體，這些抗體分子識別抗原的表位不盡相同。 ①從純化方式來看：采用ProteinA/G純化的多抗摻雜有動物本身產生的對其自身抗原產生的抗體，這些抗體在檢測中會識別樣本中的蛋白而出現雜帶；采用抗原親和純化的多抗隻包括識別免疫原的抗體分子可以避免雜帶的產生； ②從蛋白修飾來看：天然蛋白存在複雜的翻譯後修飾。甲基化、乙酰化對分子量變化影響小，而磷酸化、糖基化、泛素化可能會使部分蛋白分子量偏大，當然也存在翻譯後修飾後條帶變小的情況。 ③從蛋白翻譯後加工來看：翻譯後蛋白前體經切割可能會使部分蛋白分子量偏小，而天然組織中同時存在蛋白前體和切割加工後的蛋白，二者序列有相同部分，可能會產生雜帶。 ④從同源家族蛋白來看：當目的蛋白有同源家族蛋白時，蛋白異構體的存在可能會使分子量偏離預測分子量，因為天然樣本中由同一個mRNA不同的剪接方式進行翻譯形成的蛋白產物也會有相同的抗原表位，同時被抗體識別時會產生雜帶。這點可以通過信息學分析進行解釋。 ⑤從蛋白聚集形式來看：蛋白多聚體的形成，雖然還原條件可以抑製多聚體的形成，但是強烈的蛋白間相互作用在還原條件下也有可能不解聚導致條帶偏大。這點需要通過查閱與目的蛋白相關文獻進行了解。 ⑥從抗體特異性來看，如果待測樣本中有與目標蛋白同源性較高的組分，在驗證時也會出現雜交信號，其次多克隆抗體是通過動物免疫，製備抗血清進而純化得到多抗的，如果免疫宿主本身含有的抗體跟待測樣本有交叉，同樣也會出現信號。 簡要解釋： a、純化方式，我們目前采用的是ProteinA/G親和純化，純化的多抗也包含了兔子自身的IgG抗體； b、蛋白修飾：天然蛋白存在複雜的翻譯後修飾，有的甚至會影響條帶的大小； c、蛋白翻譯後加工的作用，導致不同剪切體出現，兩者之間若有相同部分，也會產生雜帶； d、同源家族蛋白的影響； e、蛋白多聚體的影響，雖然還原條件可以抑製多聚體的形成，但也會有不解聚的情況導致條帶偏大； f、抗體特異性，多抗是通過動物免疫，製備抗血清純化而來，如果免疫宿主本身含有的抗體跟待測樣本有交叉，也會出現雜交信號。

出現這種情況我們現在的技術水平很難解釋，我們猜想可能的原因是： ①突變體混入陽性樣本； ②生物體樣本發生基因的代償； ③同源家族蛋白較多，即便目的基因敲除或者移碼或者截短，如果抗體識別的表位是同源蛋白共有的或者移碼前的或者截短前的，那麼驗證突變體樣本依然會有條帶； ④突變體構建不成功 由於這些原因很難驗證，所有我們才會有不驗證突變體的提議。如果後續客戶一定要做，認為這是驗證抗體特異性的標準，那麼必須提供突變體樣本PCR測序結果，同時按照我們的要求發送文檔，顯示具體的突變位點，我們在接收到樣本之後，也會先進行檢測，在以上信息均確認的基礎上，再擬定合同，啟動實驗！ ⑤對於植物樣本： 植物蛋白之間的相互作用太複雜了，多為多倍體，而且很多在數據庫也沒信息可查詢，至於是否會出現基因代償等作用，或者敲除某一個基因，但是跟它有類似功能的高同源基因會不會替代或者促進被突變的恢複正常表達等等，應該目前都沒辦法解釋吧，因為我也不是做這塊的，細致的蛋白功能研究，我確實不懂，也隻是跟其他研究這塊的老師有過溝通，所以目前這個HSP82目前我們隻能做到這種程度了，即便再做我也沒有信心做好，因為剛才提到的那個高同源性基因的問題確實存在。

要想做好磷酸化蛋白的WB檢測，樣本抽提是很關鍵的一步，但是卻又是最容易出現問題的一步，因為處於不同細胞生長狀態或者特定細胞周期時，磷酸化蛋白可能僅占細胞總蛋白的一小部分，而且處理不當時，樣品還會快速的去磷酸化；其次蛋白抽提的效率，並不是所有的蛋白都能被抽提到可溶性組分中，而且目前已有不少文獻證明，很多蛋白存在於被舍棄的沉澱中，所以如果蛋白抽提過程中目標蛋白被損失了一部分，那麼磷酸化和非磷酸化蛋白之間的比例就會發生變化，導致數據偏差；最後還有WB操作過程中的一些條件控製，比如封閉問題，抗體使用比例問題，或者待檢測的磷酸化蛋白量低於WB的檢測限等等，都有可能造成最終WB實驗的檢測失敗！