服務介紹
雙分子熒光互補（Bimolecular Fluorescent Complimentary，BiFC）技術基於蛋白質片段互補的原理，用於研究蛋白質間的相互作用。其原理是將熒光蛋白（如綠色熒光蛋白GFP、黃色熒光蛋白YFP等）切割為兩個互補但各自不發光的片段（如N端和C端片段），分別與待檢測的蛋白質A和B融合表達。當蛋白質A與蛋白質B在細胞內發生相互作用時，熒光蛋白片段靠近並重組為完整的熒光蛋白，從而在顯微鏡下產生熒光信號，直觀地反映了蛋白質間的相互作用。
服務優勢
- 活細胞內檢測：能夠在細胞生理狀態下直接觀察蛋白質相互作用，保留了時空動態信息。
- 高特異性：隻有當目標蛋白相互作用時，熒光信號才會出現，減少了假陽性結果，提高了檢測的特異性。
- 多色標記：通過使用不同顏色的熒光蛋白對，可同時檢測多個蛋白質相互作用，實現多維度、多層次的蛋白質互作網絡研究。
- 直觀且定量：通過熒光強度衡量互作程度，可以通過熒光強度定量分析軟件進行半定量或定量評估，為研究蛋白質互作的動態變化和強度提供直觀且量化的數據。
- 適用於多種生物體係：廣泛適用於動物、植物、微生物等生物體係，在植物研究中，尤其適用於研究蛋白質在特定細胞器、細胞結構或特定生理條件下的互作。
- 檢測弱或瞬時相互作用：對低親和力、短暫相互作用敏感，能夠揭示一些傳統方法難以檢測到的相互作用。
服務流程
客戶提供
蛋白序列信息
1、客⼾提供載體/模板：需要提供載體mcs測序報告/模板測序結果，如⽆測序報告則需另外收取測序費⽤，由⾦開瑞代為測序。
2、客⼾提供菌液：菌液量應≥0.5mL，放置⼀年以上的⽢油菌需活化後送樣。
3、客⼾提供質粒：質粒量≥5μg。
4、菌液和液態質粒均需冰袋運輸。
最終交付
- 剩餘質粒；
- 陰、陽對照各拍1個視野，2個單分子對照和1個實驗組各拍5個視野，每個視野含YFP、Bright field、Merge 3張圖；
- 結題報告以及全部原始數據。
服務說明
1、默認在煙草中進行驗證，分組如圖所示；
2、判定實驗成功的標準：陽性對照有熒光，且陰性對照無熒光；
3、在陰陽對照正常的前提下，若實驗組檢測到熒光，說明兩個蛋白能夠互作，反之說明不互作。
常見問題與解析 (Q&A)
A：為了確保熒光信號的真實性，需要排除假陽性的可能性。假陽性可能是由於熒光蛋白片段的非特異性相互作用或其他非目標蛋白質之間的相互作用引起的。因此，在實驗中應設置對照組，如單獨表達熒光蛋白片段或目標蛋白的對照組，以排除非特異性相互作用的幹擾。此外，還可以結合其他實驗方法，如免疫共沉澱（Co-IP）、共定位、酵母雜交等，來進一步驗證蛋白質相互作用。
A：熒光信號較弱可能是由於熒光蛋白片段與目標蛋白的融合效率不高，或者融合蛋白在細胞內的表達量較低。為了優化熒光信號，可以嚐試增強啟動子，以提高融合蛋白的表達水平。此外，還可以優化轉染條件，確保細胞具有較高的轉染效率。在製片過程中，應盡可能清理幹淨葉片表麵的雜質，排除氣泡，以減少背景幹擾。
A：可能的原因有多種。首先，可能是所研究的蛋白質之間確實不存在相互作用，因此無法形成完整的熒光蛋白。其次，可能是熒光蛋白片段與目標蛋白的融合構建存在問題，導致融合蛋白不能正確表達或折疊。此外，實驗條件、細胞狀態或轉染效率等因素也可能影響熒光信號的檢測。針對這種情況，建議重複實驗，優化實驗條件，並檢查融合蛋白的表達情況。
A：BiFC技術對實驗條件確實有一些特殊要求。首先，溫度是影響BiFC實驗結果的重要因素。由於該係統對溫度敏感，較高的溫度可能導致熒光蛋白片段不易互補形成完整的熒光蛋白，因此需要在適當的溫度下進行實驗。其次，細胞的生長狀態和轉染效率也會影響實驗結果，因此需要控製好細胞的培養條件和轉染條件。此外，為了避免背景熒光的幹擾，實驗過程中需要注意操作細節，如保持實驗環境的清潔、避免光線的直接照射等。
相關技術服務
相關資源
1、BIFC技術應用
● 蛋白質互作網絡研究：揭示複雜信號通路中蛋白質間的直接相互作用。
● 細胞內定位與動態研究：觀察蛋白質相互作用在細胞內的空間分布及其隨時間的變化。
● 藥物篩選與驗證：檢測候選藥物對特定蛋白質相互作用的影響，評估其生物活性。
● 植物科學：研究植物生長發育、逆境響應、信號傳遞等過程中的關鍵蛋白質互作。
● 神經科學：揭示神經元間或神經元內部蛋白質的相互作用，如突觸形成、神經遞質釋放、離子通道調控等。
● 癌症研究：研究致癌基因與抑癌基因、癌蛋白與微環境因素的相互作用，揭示癌症發生發展的分子機製，為診斷、預後評估和個性化治療提供依據。
2、BIFC實驗流程
● 構建融合蛋白：設計並合成針對目標蛋白A和B的特異性引物，將其分別與熒光蛋白N端和C端片段基因融合，構建相應的表達載體。
● 細胞轉染：將含有融合蛋白A-N端和B-C端片段的載體同時或分別轉入感興趣的細胞係，實現融合蛋白的共表達。
● 熒光觀察：轉染後一段時間（通常24-48小時），使用熒光顯微鏡或共聚焦顯微鏡觀察細胞，若觀察到綠色（或對應熒光蛋白顏色）熒光信號，說明蛋白質A和B發生了相互作用。
3、BIFC實驗優化與注意事項
● 融合片段選擇：選擇對熒光蛋白功能影響較小的片段融合位點，確保片段重組後熒光蛋白功能恢複。
● 熒光蛋白選擇：考慮熒光蛋白的亮度、穩定性、光譜特性等因素，選擇最適合實驗條件的熒光蛋白。
● 對照設置：包括陰性對照（表達單個熒光蛋白片段的細胞）和陽性對照（已知存在相互作用的蛋白質對）。
● 轉染效率與表達水平監控：確保細胞轉染效率足夠高，且融合蛋白表達水平適中，避免過表達幹擾。
4、幾種常見的蛋白互作研究方法的對比分析：
|
方法 |
原理 | 優點 | 缺點 |
|
利用酵母細胞中的轉錄因子進行互作蛋白的篩選 |
適用於高通量篩選互作蛋白 | 假陽性較高，需進行驗證 | |
| 利用抗體與抗原的特異性結合，沉澱互作蛋白 | 可用於研究完整細胞內的蛋白互作 | 不適用於結合力弱或瞬間結合的蛋白 | |
| 利用GST融合蛋白與穀胱甘肽的結合特性，釣取互作蛋白 | 可用於體外驗證蛋白互作 | 可能存在非特異性結合 | |
|
雙分子熒光互補（BiFC） |
利用熒光蛋白片段的互補特性，觀察蛋白互作的熒光信號 |
可實時監測蛋白互作的動態過程 | 可能受熒光蛋白片段選擇、細胞類型等因素影響 |
|
免疫熒光共定位 |
利用熒光標記的抗體檢測蛋白在細胞內的定位 | 可用於研究蛋白在細胞內的分布和互作關係 | 需要進行多重染色和顯微觀察，操作複雜 |
|
蛋白質芯片 |
將蛋白質固定在芯片上，與待測蛋白進行互作反應 | 可高通量篩選互作蛋白 | 芯片製備複雜，成本較高 |
每種方法都有其獨特的優點和局限性，研究者應根據實驗目的、細胞類型、蛋白特性等因素選擇合適的方法。此外，通常建議采用多種方法進行相互驗證，以提高結果的可靠性和準確性。
